Il sequenziamento del genoma
Come si determina la sequenza nucleotidica del DNA
Il sequenziamento del DNA è un’importante tecnica che permette di stabilire la sequenza delle basi di una molecola di DNA e che si basa sull’utilizzo di nucleosidi modificati artificialmente. Come abbiamo già visto, i desossiribonucleosidi trifosfati (dNTP) che costituiscono il normale substrato per la duplicazione del DNA contengono lo zucchero desossiribosio.
Se sostituiamo questo zucchero con il 2,3-didesossiribosio, i didesossiribonucleosidi trifosfati (ddNTP) risultanti sono aggiunti dalla DNA polimerasi a una catena in allungamento come se fossero nucelotidi normali; essendo però privi del gruppo ossidrile in posizione 3', essi non consentono l’aggiunta del nucleotide successivo (▶figura A). Pertanto la sintesi si arresta nella posizione in cui all’estremità in crescita del filamento di DNA è stato incorporato il nucleoside modificato.
Per stabilire la sequenza del DNA (▶figura B) si denatura un frammento di lunghezza inferiore alle 700 coppie di basi; il filamento singolo risultante viene messo in una provetta insieme a:
- una DNA polimerasi per sintetizzare il filamento complementare;
- alcuni brevi primer sintetizzati artificialmente;
- i quattro desossiribonucleosidi trifosfati (dATP, dGTP, dCTP e dTTP);
- piccole quantità dei quattro didesossiribonucleosidi trifosfati, ciascuno legato a un’«etichetta» fluorescente che emette una luce di colore diverso.
La duplicazione del DNA va avanti e ben presto nella provetta troviamo una miscela contenente i filamenti di DNA che hanno fatto da stampo e i nuovi filamenti complementari più brevi. I nuovi filamenti, che terminano ciascuno con un didesossiribonucleoside fluorescente, sono di lunghezza variabile. Infatti, ogni volta che sullo stampo compare, poniamo, una T nel filamento complementare in formazione la DNA polimerasi potrà aggiungere un dATP o un ddATP; in quest’ultimo caso però la sintesi si interrompe.
Si lascia che la duplicazione del DNA vada avanti per un certo lasso di tempo e poi si denaturano i nuovi frammenti di DNA staccandoli dai loro stampi. Quindi i frammenti vengono sottoposti a elettroforesi; mentre migrano attraverso il gel, i frammenti sono attraversati da un raggio laser che eccita i marcatori fluorescenti. La luce emessa viene intercettata e l’informazione così ottenuta – quale colore della fluorescenza ovvero quale didesossiribonucleoside si trova all’estremità del frammento – viene inserita in un computer. Il computer elabora l’informazione e produce la sequenza del frammento di DNA.
Il metodo che abbiamo descritto è il più usato attualmente e si chiama Sanger, dal nome del suo creatore, il chimico britannico che per tale scoperta (avvenuta nel 1975) vinse il premio Nobel nel 1980.