Capitolo

Il sequenziamento del genoma

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Come si determina la sequenza nucleotidica del DNA

Il sequenziamento del DNA è un’importante tecnica che permette di stabilire la sequenza delle basi di una molecola di DNA e che si basa sull’utilizzo di nucleosidi modificati artificialmente. Come abbiamo già visto, i desossiribonucleosidi trifosfati (dNTP) che costituiscono il normale substrato per la duplicazione del DNA contengono lo zucchero desossiribosio.

Se sostituiamo questo zucchero con il 2,3-didesossiribosio, i didesossiribonucleosidi trifosfati (ddNTP) risultanti sono aggiunti dalla DNA polimerasi a una catena in allungamento come se fossero nucelotidi normali; essendo però privi del gruppo ossidrile in posizione 3', essi non consentono l’aggiunta del nucleotide successivo (▶figura A). Pertanto la sintesi si arresta nella posizione in cui all’estremità in crescita del filamento di DNA è stato incorporato il nucleoside modificato.

Per stabilire la sequenza del DNA (▶figura B) si denatura un frammento di lunghezza inferiore alle 700 coppie di basi; il filamento singolo risultante viene messo in una provetta insieme a:

  • una DNA polimerasi per sintetizzare il filamento complementare;
  • alcuni brevi primer sintetizzati artificialmente;
  • i quattro desossiribonucleosidi trifosfati (dATP, dGTP, dCTP e dTTP);
  • piccole quantità dei quattro didesossiribonucleosidi trifosfati, ciascuno legato a un’«etichetta» fluorescente che emette una luce di colore diverso.

La duplicazione del DNA va avanti e ben presto nella provetta troviamo una miscela contenente i filamenti di DNA che hanno fatto da stampo e i nuovi filamenti complementari più brevi. I nuovi filamenti, che terminano ciascuno con un didesossiribonucleoside fluorescente, sono di lunghezza variabile. Infatti, ogni volta che sullo stampo compare, poniamo, una T nel filamento complementare in formazione la DNA polimerasi potrà aggiungere un dATP o un ddATP; in quest’ultimo caso però la sintesi si interrompe.

Si lascia che la duplicazione del DNA vada avanti per un certo lasso di tempo e poi si denaturano i nuovi frammenti di DNA staccandoli dai loro stampi. Quindi i frammenti vengono sottoposti a elettroforesi; mentre migrano attraverso il gel, i frammenti sono attraversati da un raggio laser che eccita i marcatori fluorescenti. La luce emessa viene intercettata e l’informazione così ottenuta – quale colore della fluorescenza ovvero quale didesossiribonucleoside si trova all’estremità del frammento – viene inserita in un computer. Il computer elabora l’informazione e produce la sequenza del frammento di DNA.

Il metodo che abbiamo descritto è il più usato attualmente e si chiama Sanger, dal nome del suo creatore, il chimico britannico che per tale scoperta (avvenuta nel 1975) vinse il premio Nobel nel 1980.

Figura A
Figura Aopen

Confronto fra dNTP e ddNTP

Le due formule chimiche evidenziano la differenza tra i nucleotidi.
Figura B
Figura Bopen

Le tappe del sequenziamento

In questo schema sono descritte le tecniche per sequenziare il DNA.

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