Capitolo

La tec­ni­ca del DNA ri­com­bi­nan­te è al­la ba­se del­le mo­der­ne bio­tec­no­lo­gie

Per ricombinare i frammenti di DNA servono le DNA ligasi

Tut­te le cel­lu­le con­ten­go­no en­zi­mi chia­ma­ti DNA ligasi che du­ran­te il pro­ces­so di du­pli­ca­zio­ne del DNA uni­sco­no i fram­men­ti di Oka­za­ki (ve­di ▶capitolo B3). Quan­do i bio­lo­gi riu­sci­ro­no a iso­la­re ta­li en­zi­mi, si re­se­ro con­to che po­te­va­no es­se­re uti­li per sal­da­re in­sie­me due se­quen­ze qual­sia­si di DNA. Nel 1973, Stan­ley Co­hen e Her­bert Boyer (▶figura 3) ta­glia­ro­no con en­zi­mi di re­stri­zio­ne e poi uni­ro­no con una DNA li­ga­si due plasmidi di E. co­li, cia­scu­no con­te­nen­te un ge­ne per la re­si­sten­za agli an­ti­bio­ti­ci. Il pla­smi­de ri­sul­tan­te, una vol­ta rein­se­ri­to in cel­lu­le di E. co­li, le re­se re­si­sten­ti a en­tram­bi gli an­ti­bio­ti­ci. Era ap­pe­na ini­zia­ta l’e­ra del DNA ricombinante.

Co­me si ot­tie­ne la ricombinazione? Sap­pia­mo che mol­ti en­zi­mi di re­stri­zio­ne ef­fet­tua­no ta­gli sfal­sa­ti a li­vel­lo di una se­quen­za di ri­co­no­sci­men­to pa­lin­dro­ma. In que­sto ca­so, i frammenti di restrizione ter­mi­na­no con due estre­mi­tà a fi­la­men­to sin­go­lo. Ta­li estre­mi­tà con­ten­go­no una se­quen­za di ba­si ca­pa­ce di le­gar­si a un’al­tra per com­ple­men­ta­rie­tà, per­ciò so­no de­fi­ni­te estremità coesive (▶figura 4).

Dal mo­men­to che con­ten­go­no estre­mi­tà coe­si­ve com­ple­men­ta­ri, i fram­men­ti di re­stri­zio­ne pos­so­no unir­si tra lo­ro in se­gui­to al­la for­ma­zio­ne di le­ga­mi a idro­ge­no tra le ba­si, in­di­pen­den­te­men­te dal­la lo­ro ori­gi­ne: ciò av­vie­ne gra­zie al­le DNA li­ga­si, che sta­bi­liz­za­no i le­ga­mi tra fram­men­ti adia­cen­ti unen­do l’e­stre­mi­tà 5' di uno di es­si con l’e­stre­mi­tà 3' di quel­lo vi­ci­no. Al­cu­ne DNA li­ga­si so­no in gra­do di uni­re (con mec­ca­ni­smi un po’ di­ver­si) an­che fram­men­ti di re­stri­zio­ne con estre­mi­tà «piat­te».

Le li­ga­si so­no mol­to sen­si­bi­li al­la tem­pe­ra­tu­ra (che ha mol­ta in­fluen­za sui le­ga­mi a idro­ge­no) e ri­chie­do­no ATP per fun­zio­na­re. Uti­liz­zan­do que­sti en­zi­mi, i bio­lo­gi mo­le­co­la­ri rie­sco­no a pro­dur­re DNA ri­com­bi­nan­te «ta­glian­do e cu­cen­do» mo­le­co­le di DNA pro­ve­nien­ti dal­le fon­ti più di­ver­se. Per po­ter uni­re mo­le­co­le di pro­ve­nien­za di­ver­sa è pe­rò ne­ces­sa­rio che le estre­mi­tà coe­si­ve dei due fram­men­ti sia­no com­ple­men­ta­ri; ciò è pos­si­bi­le so­lo se en­tram­bi so­no sta­ti ta­glia­ti dal me­de­si­mo en­zi­ma di re­stri­zio­ne.

Figura
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Il DNA ricombinante

Co­hen e Boyer rea­liz­za­ro­no il pri­mo espe­ri­men­to in cui due di­ver­se se­quen­ze di DNA si com­bi­na­va­no in la­bo­ra­to­rio per ot­te­ne­re una nuo­va mo­le­co­la di DNA fun­zio­na­le.
Figura 4
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Tagliare e cucire il DNA

Al­cu­ni en­zi­mi di re­stri­zio­ne (è mo­stra­to l’e­sem­pio re­la­ti­vo a Eco RI) pra­ti­ca­no ta­gli sfal­sa­ti nel­le mo­le­co­le di DNA. Eco RI può es­se­re usa­to per ta­glia­re il DNA pro­ve­nien­te da due fon­ti di­ver­se (blu e gial­lo). I ta­gli la­scia­no del­le estre­mi­tà coe­si­ve che pos­so­no ibri­dar­si con fram­men­ti com­ple­men­ta­ri. Le estre­mi­tà coe­si­ve di DNA di­ver­si pos­so­no le­gar­si le une al­le al­tre, dan­do ori­gi­ne a DNA ri­com­bi­nan­te.

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