La tecnica del DNA ricombinante è alla base delle moderne biotecnologie
Per ricombinare i frammenti di DNA servono le DNA ligasi
Tutte le cellule contengono enzimi chiamati DNA ligasi che durante il processo di duplicazione del DNA uniscono i frammenti di Okazaki (vedi ▶capitolo B3). Quando i biologi riuscirono a isolare tali enzimi, si resero conto che potevano essere utili per saldare insieme due sequenze qualsiasi di DNA. Nel 1973, Stanley Cohen e Herbert Boyer (▶figura 3) tagliarono con enzimi di restrizione e poi unirono con una DNA ligasi due plasmidi di E. coli, ciascuno contenente un gene per la resistenza agli antibiotici. Il plasmide risultante, una volta reinserito in cellule di E. coli, le rese resistenti a entrambi gli antibiotici. Era appena iniziata l’era del DNA ricombinante.
Come si ottiene la ricombinazione? Sappiamo che molti enzimi di restrizione effettuano tagli sfalsati a livello di una sequenza di riconoscimento palindroma. In questo caso, i frammenti di restrizione terminano con due estremità a filamento singolo. Tali estremità contengono una sequenza di basi capace di legarsi a un’altra per complementarietà, perciò sono definite estremità coesive (▶figura 4).
Dal momento che contengono estremità coesive complementari, i frammenti di restrizione possono unirsi tra loro in seguito alla formazione di legami a idrogeno tra le basi, indipendentemente dalla loro origine: ciò avviene grazie alle DNA ligasi, che stabilizzano i legami tra frammenti adiacenti unendo l’estremità 5' di uno di essi con l’estremità 3' di quello vicino. Alcune DNA ligasi sono in grado di unire (con meccanismi un po’ diversi) anche frammenti di restrizione con estremità «piatte».
Le ligasi sono molto sensibili alla temperatura (che ha molta influenza sui legami a idrogeno) e richiedono ATP per funzionare. Utilizzando questi enzimi, i biologi molecolari riescono a produrre DNA ricombinante «tagliando e cucendo» molecole di DNA provenienti dalle fonti più diverse. Per poter unire molecole di provenienza diversa è però necessario che le estremità coesive dei due frammenti siano complementari; ciò è possibile solo se entrambi sono stati tagliati dal medesimo enzima di restrizione.