La duplicazione semiconservativa del DNA richiede precise condizioni: oltre ai nucleosidi trifosfati necessari per costruire la nuova molecola, è indispensabile la presenza di un DNA preesistente, di un complesso di replicazione, di un innesco (o primer) e di numerose proteine.

La duplicazione avviene in due tappe:

1. La doppia elica del DNA, con l’aiuto di specifici enzimi, si despiralizza e si rompono i legami a idrogeno tra basi appaiate, per permettere l’allontanamento dei due filamenti stampo e renderli disponibili all’appaiamento con nuove basi.
2. I nuovi nucleotidi si uniscono mediante legami fosfodiesterici a ciascun nuovo filamento in crescita secondo una sequenza determinata dall’appaiamento per complementarietà con le basi del filamento stampo. La formazione dei legami fosfodiesterici è catalizzata da enzimi chiamati DNA polimerasi.

Un punto importante da ricordare è che i nucleotidi si vanno ad aggiungere al nuovo filamento in accrescimento solo all’estremità 3', quella dove il filamento di DNA presenta un gruppo ossidrile (–OH) libero sul carbonio 3' del desossiribosio terminale (▶figura 11). Uno dei tre gruppi fosfato del desossiribonucleoside trifosfato si lega alla posizione 5' dello zucchero, e l’energia necessaria alla reazione è liberata dalla rottura dei legami fra il nucleotide e gli altri due gruppi fosfato.