Gli enzimi appartenenti alla classe delle DNA polimerasi (▶figura 13A) sono molecole molto più grandi dei desossiribonucleosidi trifosfati e anche del DNA stampo, che è lungo ma sottile. I modelli molecolari del complesso batterico enzima-substrato-stampo mostrano un enzima che assomiglia a una mano semiaperta, con il palmo che contiene il sito attivo dell’enzima e avvicina il substrato allo stampo e con le quattro dita conformate in modo da riconoscere la forma delle quattro diverse basi nucleotidiche (▶figura 13B). Le DNA polimerasi possiedono due caratteristiche importanti:

1. Sono capaci di allungare un filamento polinucleotidico legando in modo covalente un nucleotide per volta a un filamento preesistente, ma non riescono ad iniziarne uno dal nulla. Per questo serve un filamento di avvio, detto primer (o innesco). Nella duplicazione del DNA, il primer è un breve filamento singolo di RNA (▶figura 14). Questo filamento di RNA, complementare al filamento stampo del DNA, è sintetizzato, nucleotide dopo nucleotide, da un enzima chiamato primasi. Al termine della duplicazione, il primer viene eliminato e sostituito da DNA.
2. Le DNA polimerasi lavorano in una sola direzione: aggiungono nucleotidi solo all’estremità 3' del primer fino al completamento della duplicazione di quel tratto di DNA.

Di conseguenza, l’allungamento procede in modo diverso sui due filamenti antiparalleli di DNA:

• la sintesi del filamento che ha l’estremità 3' libera in corrispondenza della forcella procede in modo continuo: questo filamento è detto filamento veloce;
• la sintesi dell’altro filamento, detto filamento lento, procede in modo discontinuo e a ritroso, operando su segmenti isolati e relativamente piccoli (100-200 nucleotidi per volta negli eucarioti e 1000-2000 nei procarioti).

Ciò accade perché il filamento lento punta nella direzione «sbagliata»: a mano a mano che la forcella si apre, la sua estremità 3' libera si allontana sempre di più dal punto di apertura cosicché si viene a formare uno spazio vuoto, non duplicato, che sarebbe destinato a diventare sempre più ampio. Per risolvere il problema vengono quindi prodotti brevi segmenti discontinui, detti frammenti di Okazaki (dal nome del loro scopritore, il biochimico giapponese Reiji Okazaki), che poi vengono uniti insieme (▶figura 15).

I segmenti di Okazaki sono sintetizzati allo stesso modo del filamento veloce, cioè per aggiunta di un nuovo nucleotide per volta all’estremità 3' del nuovo filamento; la sintesi del filamento lento, però, procede in direzione opposta rispetto all’apertura della forcella di duplicazione.

Per la sintesi del filamento veloce basta un solo primer, ma per il filamento lento ogni frammento di Okazaki ha bisogno di un proprio primer. Nei batteri, una DNA polimerasi parte da un primer e sintetizza i frammenti di Okazaki fino a raggiungere il primer del frammento precedente. A questo punto un’altra polimerasi rimuove il vecchio primer e lo sostituisce con DNA, lasciando un piccolo stacco dovuto all’assenza del legame fosfodiesterico terminale fra due frammenti di Okazaki adiacenti. La formazione di questo legame è poi catalizzata da un altro enzima, la DNA ligasi, che unisce i frammenti producendo un filamento lento completo.