Il caricamento di ciascun tRNA con il proprio amminoacido è realizzato da una famiglia di enzimi attivanti noti come amminoacil-tRNA-sintetasi. Ogni enzima attivante è specifico per un solo amminoacido e per il suo tRNA corrispondente.

Grazie alla sua struttura tridimensionale (▶figura 8), il tRNA viene riconosciuto dall’enzima attivante in modo assolutamente specifico, con un tasso di errore molto basso; anche il tasso di errore nel riconoscimento dell’amminoacido è molto basso, dell’ordine di 1 su 1000.

L’amminoacido si attacca all’estremità 3' del tRNA con un legame ricco di energia, formando un tRNA carico. Questo legame fornirà l’energia necessaria alla formazione del legame peptidico che manterrà uniti gli amminoacidi adiacenti.