La pubblicazione originaria di Watson e Crick suggeriva una modalità di duplicazione del DNA di tipo semiconservativo (▶figura 10). Ricerche successive dimostrarono che il suggerimento era corretto: ogni filamento parentale funziona da stampo per un nuovo filamento, cosicché le due molecole di DNA neoformate contengono un filamento vecchio e uno nuovo.

Il primo esperimento, svolto da Arthur Kornberg, dimostrò che era possibile sintetizzare un nuovo DNA con la stessa composizione di basi di un DNA di partenza in una provetta che conteneva tre tipi di sostanze:

1. i quattro desossiribonucleosidi trifosfati dATP, dCTP, dGTP e dTTP (molecole contenenti ciascuna una base azotata legata al desossiribosio, a sua volta legata a tre gruppi fosfato);
2. l’enzima DNA polimerasi;
3. un DNA che serviva da stampo per guidare l’ingresso dei nucleosidi.

L’esperimento di Kornberg, tuttavia, non permetteva di elaborare un modello su come avvenisse la duplicazione: ogni nuova molecola conteneva un filamento «vecchio» e uno neosintetizzato? Oppure, la molecola di partenza serviva solo da «stampo»? La dimostrazione che la duplicazione del DNA è semiconservativa si deve al lavoro di Meselson e Stahl.

La duplicazione semiconservativa del DNA richiede precise condizioni: oltre ai nucleosidi trifosfati necessari per costruire la nuova molecola, è indispensabile la presenza di un DNA preesistente, di un complesso di replicazione, di un innesco (o primer) e di numerose proteine.

La duplicazione avviene in due tappe:

1. La doppia elica del DNA, con l’aiuto di specifici enzimi, si despiralizza e si rompono i legami a idrogeno tra basi appaiate, per permettere l’allontanamento dei due filamenti stampo e renderli disponibili all’appaiamento con nuove basi.
2. I nuovi nucleotidi si uniscono mediante legami fosfodiesterici a ciascun nuovo filamento in crescita secondo una sequenza determinata dall’appaiamento per complementarietà con le basi del filamento stampo. La formazione dei legami fosfodiesterici è catalizzata da enzimi chiamati DNA polimerasi.

Un punto importante da ricordare è che i nucleotidi si vanno ad aggiungere al nuovo filamento in accrescimento solo all’estremità 3', quella dove il filamento di DNA presenta un gruppo ossidrile (–OH) libero sul carbonio 3' del desossiribosio terminale (▶figura 11). Uno dei tre gruppi fosfato del desossiribonucleoside trifosfato si lega alla posizione 5' dello zucchero, e l’energia necessaria alla reazione è liberata dalla rottura dei legami fra il nucleotide e gli altri due gruppi fosfato.

Il meccanismo della duplicazione è abbastanza complicato. Perché il DNA si duplichi, il filamento stampo deve interagire con un enorme complesso proteico, detto complesso di duplicazione, che catalizza le reazioni necessarie al processo. Il complesso di duplicazione si lega al DNA in corrispondenza di una particolare sequenza di basi, detta origine della duplicazione (ori). A partire dall’origine della duplicazione, il DNA si duplica in entrambe le direzioni, formando due forcelle di duplicazione. Tutti e due i filamenti della molecola di partenza, una volta separati, agiscono contemporaneamente da stampo per la formazione di nuovi filamenti, guidata dalla complementarietà delle basi. In questa fase, dati recenti mostrano che il complesso di duplicazione sta fermo, fissato a strutture nucleari, mentre il DNA si sposta, infilandosi nel complesso come filamento singolo e riemergendone a doppio filamento (▶figura 12).

Tutti i complessi di duplicazione contengono alcune proteine che svolgono svariate funzioni e che descriveremo nel prendere in esame le fasi del processo. Il primo evento che si verifica nel punto di origine della duplicazione è l’apertura (denaturazione) localizzata del DNA: un enzima elimina i legami idrogeno e le interazioni idrofobiche che tengono insieme i due filamenti, mentre un altro enzima si lega ai filamenti despiralizzati per impedire che si riassocino. Ora i due stampi sono disponibili per appaiarsi in modo complementare a nuove basi.

I piccoli cromosomi circolari dei batteri possiedono una sola origine della duplicazione. Intanto che il DNA attraversa il complesso di duplicazione, le forcelle si allargano in senso circolare formando due molecole di DNA intrecciate, che poi vengono separate da un apposito enzima.

Le DNA polimerasi lavorano molto rapidamente: nel batterio E. coli la duplicazione procede alla velocità di 1000 basi al secondo, cosicché i suoi 4,7 milioni di basi si duplicano in appena 20-40 minuti. Le polimerasi umane sono più lente (50 basi al secondo), inoltre i cromosomi sono molto più lunghi (circa 80 milioni di basi): per sbrigare il lavoro in meno di un’ora ci vogliono molte polimerasi e centinaia di complessi di duplicazione che lavorano in parallelo uno di fianco all’altro lungo il cromosoma.

Gli enzimi appartenenti alla classe delle DNA polimerasi (▶figura 13A) sono molecole molto più grandi dei desossiribonucleosidi trifosfati e anche del DNA stampo, che è lungo ma sottile. I modelli molecolari del complesso batterico enzima-substrato-stampo mostrano un enzima che assomiglia a una mano semiaperta, con il palmo che contiene il sito attivo dell’enzima e avvicina il substrato allo stampo e con le quattro dita conformate in modo da riconoscere la forma delle quattro diverse basi nucleotidiche (▶figura 13B). Le DNA polimerasi possiedono due caratteristiche importanti:

1. Sono capaci di allungare un filamento polinucleotidico legando in modo covalente un nucleotide per volta a un filamento preesistente, ma non riescono ad iniziarne uno dal nulla. Per questo serve un filamento di avvio, detto primer (o innesco). Nella duplicazione del DNA, il primer è un breve filamento singolo di RNA (▶figura 14). Questo filamento di RNA, complementare al filamento stampo del DNA, è sintetizzato, nucleotide dopo nucleotide, da un enzima chiamato primasi. Al termine della duplicazione, il primer viene eliminato e sostituito da DNA.
2. Le DNA polimerasi lavorano in una sola direzione: aggiungono nucleotidi solo all’estremità 3' del primer fino al completamento della duplicazione di quel tratto di DNA.

Di conseguenza, l’allungamento procede in modo diverso sui due filamenti antiparalleli di DNA:

• la sintesi del filamento che ha l’estremità 3' libera in corrispondenza della forcella procede in modo continuo: questo filamento è detto filamento veloce;
• la sintesi dell’altro filamento, detto filamento lento, procede in modo discontinuo e a ritroso, operando su segmenti isolati e relativamente piccoli (100-200 nucleotidi per volta negli eucarioti e 1000-2000 nei procarioti).

Ciò accade perché il filamento lento punta nella direzione «sbagliata»: a mano a mano che la forcella si apre, la sua estremità 3' libera si allontana sempre di più dal punto di apertura cosicché si viene a formare uno spazio vuoto, non duplicato, che sarebbe destinato a diventare sempre più ampio. Per risolvere il problema vengono quindi prodotti brevi segmenti discontinui, detti frammenti di Okazaki (dal nome del loro scopritore, il biochimico giapponese Reiji Okazaki), che poi vengono uniti insieme (▶figura 15).

I segmenti di Okazaki sono sintetizzati allo stesso modo del filamento veloce, cioè per aggiunta di un nuovo nucleotide per volta all’estremità 3' del nuovo filamento; la sintesi del filamento lento, però, procede in direzione opposta rispetto all’apertura della forcella di duplicazione.

Per la sintesi del filamento veloce basta un solo primer, ma per il filamento lento ogni frammento di Okazaki ha bisogno di un proprio primer. Nei batteri, una DNA polimerasi parte da un primer e sintetizza i frammenti di Okazaki fino a raggiungere il primer del frammento precedente. A questo punto un’altra polimerasi rimuove il vecchio primer e lo sostituisce con DNA, lasciando un piccolo stacco dovuto all’assenza del legame fosfodiesterico terminale fra due frammenti di Okazaki adiacenti. La formazione di questo legame è poi catalizzata da un altro enzima, la DNA ligasi, che unisce i frammenti producendo un filamento lento completo.

Come abbiamo appena visto, la duplicazione del filamento lento avviene per aggiunta dei frammenti di Okazaki ai primer di RNA. Dopo la rimozione del primer terminale non è più possibile sintetizzare il DNA che lo sostituisca, perché non c’è un’estremità 3' da prolungare (in altre parole, manca un filamento di DNA complementare). Pertanto il nuovo cromosoma, formatosi con la duplicazione del DNA, presenta a entrambe le estremità un pezzetto di DNA a filamento singolo. A questo punto si attivano dei meccanismi che tagliano via la porzione a filamento singolo, insieme a una parte a filamento doppio. Di conseguenza, ad ogni divisione cellulare, il cromosoma si accorcia.

In molti eucarioti le estremità dei cromosomi portano delle sequenze ripetitive chiamate telomeri (▶figura 16A). Nella specie umana, la sequenza del telomero è TTAGGG ed è ripetuta circa 2500 volte. A questi tratti ripetuti si legano speciali proteine che mantengono stabili le estremità del cromosoma. Nei cromosomi umani, a ogni ciclo di duplicazione del DNA e di divisione cellulare il DNA telomerico può perdere da 50 a 200 coppie di basi; perciò, dopo 20-30 divisioni, i cromosomi non sono più capaci di partecipare alla divisione cellulare e la cellula muore.

La perdita dei telomeri spiega in parte perché le cellule non durano per tutta la vita dell’organismo. Eppure alcune cellule che continuano a dividersi, come le cellule del midollo osseo e le cellule produttrici dei gameti, conservano il loro DNA telomerico: in queste cellule esiste un enzima, la telomerasi, che catalizza l’aggiunta della sequenza telomerica eventualmente persa (▶figura 16B). La telomerasi contiene una sequenza di RNA che funziona da stampo per la sequenza telomerica ripetuta.

La telomerasi può essere importante nella lotta contro il cancro. Questo enzima è presente in oltre il 90% delle cellule tumorali umane e può rappresentare un elemento importante per la loro capacità di continuare a dividersi; poiché la maggior parte delle cellule non ha questa capacità, la telomerasi rappresenta un bersaglio promettente per i farmaci antitumorali.

L’interesse per la telomerasi è legato anche all’invecchiamento. Se a cellule umane in coltura si aggiunge un gene che esprime alti livelli di telomerasi, i telomeri di quelle cellule non si accorciano; anziché morire dopo 20-30 generazioni cellulari, le cellule diventano immortali. Resta da vedere se esiste una qualche relazione fra l’immortalità cellulare e l’invecchiamento dell’intero organismo. Le ricerche sui telomeri e sulla telomerasi hanno portato i loro scopritori (gli statunitensi Elizabeth Blackburn, Carol Greider e Jack Szostak) a vincere il premio Nobel per la medicina nel 2009.

Il complesso meccanismo della duplicazione del DNA è straordinariamente preciso, ma non è perfetto. Innanzitutto la DNA polimerasi compie una quantità notevole di errori: il tasso osservato in E. coli di un errore ogni 10⁵ basi duplicate, per quanto basso, produrrebbe 60 000 mutazioni ogni volta che una cellula umana si divide. Inoltre, il DNA delle cellule che non sono in divisione è soggetto a danni provocati da alterazioni chimiche naturali delle basi o da agenti ambientali. Per fortuna le cellule dispongono di almeno tre meccanismi di riparazione:

1. una correzione di bozze che corregge gli errori di a mano a mano che la DNA polimerasi li compie;
2. una riparazione delle anomalie di appaiamento, che esamina il DNA subito dopo che si è duplicato e corregge gli appaiamenti sbagliati;
3. una riparazione per escissione che elimina le basi anomale dovute a un agente chimico e le sostituisce con basi funzionali.

Ogni volta che introduce un nuovo nucleotide in un filamento polinucleotidico in allungamento, la DNA polimerasi (coadiuvata da altre proteine del complesso di duplicazione) svolge una funzione di correzione di bozze (▶figura 17A). Se si accorge di un appaiamento sbagliato, toglie il nucleotide introdotto impropriamente e ci riprova. Questo processo ha un tasso di errore di uno ogni 10 000 coppie di basi e riduce il tasso generale di errore di duplicazione a circa una base ogni 10⁹ basi duplicate.

Dopo che il DNA è stato duplicato, una seconda serie di proteine esamina la molecola neoformata in cerca di errori di appaiamento sfuggiti alla correzione di bozze (▶figura 17B). Questo meccanismo di riparazione delle anomalie è in grado di accorgersi che una coppia di basi, per esempio AC, non va bene: ma come fa a «sapere» se la coppia giusta è AT oppure GC? Il meccanismo di riparazione delle anomalie riesce a riconoscere la base sbagliata perché un filamento di DNA appena duplicato subisce dei cambiamenti chimici. Per esempio, nei procarioti ad alcune adenine si va ad aggiungere un gruppo metile (–CH₃). Subito dopo la duplicazione, il filamento neoformato, che contiene l’errore, non è ancora metilato ed è quindi riconoscibile dal meccanismo di riparazione.

Le molecole di DNA si possono danneggiare anche durante la vita della cellula a causa di radiazioni ad alta energia, di agenti chimici mutageni presenti nell’ambiente o di reazioni chimiche spontanee. Di questo tipo di danni si occupa il meccanismo di riparazione per escissione.

Appositi enzimi ispezionano costantemente il DNA della cellula (▶figura 17C) e, quando trovano basi appaiate in modo improprio, basi alterate o punti nei quali un filamento contiene più basi dell’altro (con conseguente formazione di un’ansa non appaiata), tagliano via il filamento difettoso. Un altro enzima rimuove la base colpevole e quelle adiacenti, mentre la DNA polimerasi e la DNA ligasi sintetizzano e attaccano una nuova sequenza di basi al posto di quella estirpata.