Si definisce tecnologia del DNA ricombinante l’insieme delle tecniche di laboratorio che consentono di isolare e tagliare brevi sequenze di DNA per trasferirle e inserirle nel genoma di altre cellule, in modo da modificarne uno o più geni. Questa tecnologia permette interventi mirati, che modificano in modo specifico solo i geni dei caratteri su cui si vuole agire. Inoltre, le metodologie odierne consentono di trasferire DNA non solo tra individui della stessa specie, ma anche tra specie diverse, spesso molto differenti l’una dall’altra. Si possono, per esempio, trasferire geni da un batterio a una pianta o introdurre in un batterio un gene proveniente da una cellula eucariotica.

La tecnologia del DNA ricombinante è molto complessa dal punto di vista operativo, ma dal punto di vista concettuale si basa su criteri abbastanza semplici:

• identificare il gene;
• tagliarlo e isolarlo dalla molecola del DNA;
• unire il gene a un vettore a sua volta costituito da DNA;
• trasferirlo all’interno di una cellula ricevente.

Gli scopi di questa operazione possono essere diversi: determinare un miglioramento genetico nell’individuo ricevente (per esempio, una maggiore resistenza agli attacchi dei parassiti), oppure utilizzare l’organismo ricevente per clonare il gene introdotto e servirsi della cellula ospite come una «fabbrica» per la produzione di molecole utili.

Il primo passaggio consiste sempre nel tagliare il DNA. Talvolta questa operazione serve solo per studiare meglio le caratteristiche dei frammenti ottenuti, ma il più delle volte è la premessa per una ricombinazione: si uniscono cioè molecole di DNA di provenienza diversa. Per tagliare e ricucire i geni sono necessari enzimi specifici (enzimi di restrizione e ligasi). La loro scoperta è stata la chiave che ha aperto la porta allo sviluppo di tutte le tecniche di manipolazione del DNA.

Alla fine degli anni Sessanta del Novecento si scoprì che alcuni batteri si difendono dall’attacco dei virus producendo particolari enzimi, denominati enzimi di restrizione, che tagliano le molecole di DNA estraneo riducendole in frammenti più piccoli, non infettanti (▶figura 1).

In un processo chiamato digestione da restrizione questi enzimi spezzano l’ossatura del DNA rompendo i legami tra il gruppo ossidrile all’estremità 3' di un nucleotide e il gruppo fosfato all’estremità 5' del nucleotide successivo.

Esistono numerosi enzimi di restrizione, ciascuno dei quali taglia il DNA a livello di una specifica sequenza di basi (normalmente 4-6 basi), definita sequenza di riconoscimento o sito di restrizione.

Per esempio, l’enzima EcoRI taglia il DNA soltanto quando incontra la seguente sequenza di basi appaiate nella doppia elica del DNA:

Se osservi con attenzione questa sequenza, e la leggi in direzione 5' → 3', noterai che è la stessa su entrambi i filamenti: è un palindromo, come la frase «ai lati d’Italia».

La maggior parte degli altri enzimi di restrizione lavora riconoscendo sequenze palindrome e operando un taglio «obliquo» nel filamento di DNA. Come vedremo più avanti, questi tagli «sfalsati» sono fondamentali per ottenere DNA ricombinante.

Gli enzimi di restrizione agiscono solo sul DNA estraneo e non tagliano mai il DNA della cellula batterica che li ha prodotti. Il batterio infatti protegge il proprio DNA con un meccanismo chiamato metilazione: alcuni enzimi aggiungono un gruppo metile (–CH₃) in tutti i punti del DNA batterico che potrebbero essere riconosciuti dagli enzimi di restrizione.

Gli enzimi di restrizione possono venire isolati ed estratti dalle cellule che li producono per essere utilizzati in laboratorio come se fossero delle «forbici biochimiche». Infatti il DNA di qualsiasi organismo, se incubato in provetta con un enzima di restrizione, verrà tagliato in tutti i punti in cui è presente il relativo sito di restrizione (cioè una sequenza di basi specifica).

Oggi disponiamo di centinaia di enzimi di restrizione, purificati a partire da vari microrganismi. Perciò uno stesso campione di DNA può venire tagliato da più enzimi che riconoscono siti di restrizione diversi. In questo modo i biologi molecolari possono scegliere con precisione chirurgica dove tagliare un campione di DNA optando tra molti siti diversi. I tratti di DNA che si ottengono sono chiamati frammenti di restrizione.

Poiché le sequenze di riconoscimento non si presentano a intervalli regolari, i frammenti di restrizione hanno lunghezze diverse, ed è proprio grazie a questa variabilità che li possiamo separare. Tale operazione può servire sia a stabilire il numero dei singoli frammenti, con le rispettive dimensioni molecolari, sia a individuare e purificare un frammento di particolare interesse. Come vedremo, un sistema adatto a separare o purificare i frammenti di DNA è l’elettroforesi su gel.

L’elettroforesi su gel separa i frammenti di DNA dopo il taglio con gli enzimi di restrizione utilizzando un gel di agarosio (▶figura 2A), un polisaccaride che si ricava dalle alghe.

Il gel è posto in uno stampo di forma rettangolare; a una delle estremità del gel si trovano delle piccole cavità verticali chiamate pozzetti, allineate a formare una fila. Ogni campione, composto da una miscela di frammenti di DNA e colorato con una sostanza blu, viene deposto (o «caricato») in un pozzetto; quindi si applica al gel un campo elettrico, con il polo negativo posizionato vicino ai pozzetti e il polo positivo all’estremità opposta.

A pH neutro, il DNA è carico negativamente grazie alla presenza dei gruppi fosfato; poiché le cariche opposte si attraggono, i frammenti di DNA migrano verso il polo positivo del campo elettrico. Il gel funziona da «setaccio molecolare»: le molecole piccole, infatti migrano attraverso l’agarosio più velocemente di quelle grandi. Dopo un certo intervallo di tempo si interrompe la corrente elettrica e si esamina la distanza percorsa dai frammenti; per visualizzare il DNA si usa un colorante che diventa fluorescente quando viene esposto alla luce ultravioletta (▶figura 2B).

Come puoi vedere nella figura, i frammenti si presentano come bande e possono essere esaminati o rimossi singolarmente.

L’elettroforesi su gel ci fornisce principalmente due tipi di informazione.

La dimensione dei singoli frammenti.

Per determinare le dimensioni dei frammenti si pone, in un pozzetto di fianco al campione, un marcatore costituito da DNA di dimensioni note, che serve come standard di riferimento.

La presenza di determinate sequenze di DNA.

Una sequenza nota può essere messa in evidenza all’interno del campione mediante l’uso di una sonda di DNA marcata con una sostanza radioattiva. Il campione di DNA viene denaturato (cioè despiralizzato e separato in filamenti singoli) quando è ancora nel gel e immobilizzato. In seguito, il campione viene esposto a una sonda di DNA a singolo filamento contenente una sequenza complementare a quella cercata. Se nel campione di DNA è presente la sequenza che ci interessa, la sonda si unirà ad essa. A ibridazione avvenuta, una macchia di radioattività indicherà il punto in cui la sonda ha intercettato la sequenza di DNA desiderata, mentre le sonde che non si sono legate rimarranno nella soluzione. È quindi possibile prelevare la porzione di gel corrispondente alla zona che contiene il frammento cercato (per dimensione o sequenza) e poi estrarre dal gel il frammento di DNA allo stato puro.

L’enzima EcoRI è formato da due subunità contenenti due siti attivi identici, che tagliano contemporaneamente i due filamenti tra le basi G e A. In un tipico genoma procariotico, la sequenza di riconoscimento per EcoRI si trova in media una volta ogni 40000 coppie di basi (ossia una volta ogni quattro geni). Perciò questo enzima può tagliare un grosso pezzo di DNA in frammenti più piccoli che contengono, in media, soltanto pochi geni. L’espressione «in media» non significa che l’enzima tagli tutti i frammenti a intervalli regolari. Nelle 40000 coppie di basi del fago T7, per esempio, la sequenza di riconoscimento per EcoRI non compare neppure una volta, un fatto di vitale importanza per il virus, dato che il suo ospite è proprio E. coli.

Se impiegato in laboratorio per tagliare piccoli genomi (come quelli virali che possiedono solo decine di migliaia di coppie di basi), EcoRI produrrà pochi frammenti; invece, con i grandi cromosomi eucariotici costituiti da decine di milioni di coppie di basi, si otterranno molti frammenti.

Oggi gli enzimi di restrizione si utilizzano per studiare sia il genoma dei batteri sia quello delle cellule eucariotiche. Nel caso dell’uomo, frammentando e analizzando il DNA di un enorme numero di cellule è stato possibile verificare che ciascun individuo possiede una propria «impronta genetica». Il DNA frammentato, infatti, ha caratteristiche diverse da persona a persona: esistono però delle somiglianze tra consanguinei, in particolare tra genitori e figli. Questa caratteristica viene definita polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP, che si legge «rif-lip»)

Per ottenere la cosiddetta impronta genetica (genetic fingerprint o DNA profiling), si utilizza una procedura basata su due metodi: la digestione con enzimi di restrizione, che riduce il DNA in frammenti, e l’elettroforesi su gel, che li separa in base alla dimensione.

Tale tecnica di tipizzazione del DNA è utile per identificare le persone, stabilire rapporti di parentela e cercare geni responsabili di malattie ereditarie. Per identificare una persona o stabilire parentele sono molto adatti i geni polimorfi, che presentano vari alleli e pertanto hanno un’alta probabilità di essere diversi nei singoli individui. I polimorfismi più usati sono principalmente due.

1. I polimorfismi da singolo nucleotide (SNP) sono variazioni che riguardano un’unica base nucleotidica. Per esempio, se in un determinato punto del genoma un genitore è omozigote per la base A e l’altro genitore lo è per la base G, la progenie sarà eterozigote (un cromosoma conterrà A e l’altro conterrà G).
2. Le ripetizioni brevi in tandem (STR) sono tratti di DNA contenenti sequenze di 2-10 basi che si  ripetono più volte, una di seguito all’altra, secondo uno schema preciso. Anche questi schemi di ripetizione sono ereditari: per esempio, un soggetto può ereditare dalla madre un cromosoma 15 con una breve sequenza ripetuta sei volte e dal padre un altro cromosoma 15 con la stessa sequenza ripetuta due volte. Se una STR si trova tra due sequenze di riconoscimento per un enzima di restrizione, il DNA dell’individuo eterozigote tagliato da tale enzima darà origine a due frammenti di lunghezza diversa: uno più grande (materno) e uno più piccolo (paterno). La differenza è osservabile con l’elettroforesi su gel (▶figura 3). Esaminando molte STR diverse si possono riconoscere combinazioni che caratterizzano univocamente quell’individuo.

Tuttavia, non è sempre possibile raggiungere dei risultati sicuri. La determinazione dell’impronta genetica richiede almeno 1 µg di DNA, corrispondente a quello contenuto in circa 100 000 cellule umane: una quantità non sempre disponibile. Fortunatamente, è possibile amplificare il DNA che ci interessa e ottenere così la quantità necessaria per effettuare la digestione da restrizione e l’elettroforesi. La tecnica che si utilizza per questo scopo è chiamata PCR, che analizzaremo ora.

Da quando è stata ottenuta la duplicazione del DNA in laboratorio, è possibile fare copie multiple di una sequenza di DNA. La reazione a catena della polimerasi (o PCR, dall’inglese Polymerase Chain Reaction) è una tecnica che automatizza questo processo copiando molte volte in provetta un tratto di DNA.

La PCR (▶figura 4), è un processo ciclico fatto di tappe che si ripetono molte volte:

• i filamenti di DNA a doppia elica, sottoposti a riscaldamento, si separano in filamenti singoli (denaturazione);
• si aggiunge alla soluzione un breve primer sintetizzato artificialmente, insieme ai quattro desossiribonucleosidi trifosfati e alla DNA polimerasi;
• la DNA polimerasi catalizza la produzione di nuovi filamenti complementari.

In pochi minuti, un singolo ciclo può raddoppiare la quantità di DNA presente in soluzione e lo riporta allo stato di doppio filamento. La ripetizione del ciclo per molte volte produce una crescita esponenziale del numero di copie della sequenza di DNA; per questo il processo prende il nome di amplificazione della sequenza.

La tecnica della PCR richiede la conoscenza delle sequenze di basi all’estremità 3' di ciascun filamento della sequenza bersaglio, in modo da costruire in laboratorio il primer complementare, di solito della lunghezza di 15-20 basi. Data la peculiarità di questa sequenza, nel genoma di un organismo di solito ci sarà una sola regione del DNA a cui potranno legarsi due primer di questa lunghezza. Questa specificità, a fronte dell’incredibile diversità del DNA bersaglio, è la chiave della potenza della PCR.

All’inizio esisteva un problema con la PCR: i requisiti termici. Per denaturare il DNA, infatti, bisogna scaldarlo a più di 90 °C, una temperatura che distrugge la DNA polimerasi. Se però fosse necessario aggiungere nuova polimerasi dopo ogni ciclo di denaturazione, la PCR sarebbe impraticabile.

Il problema è stato risolto dalla natura: in alcuni geyser, come anche in altre sorgenti termali, vive un batterio chiamato Thermus aquaticus. Portando avanti una ricerca di base, Thomas Brock e i suoi collaboratori scoprirono che questo organismo poteva sopravvivere a temperature fino a 95 °C grazie a un apparato metabolico termoresistente, completo di una DNA polimerasi (chiamata Taq polimerasi o polimerasi termostabile) che non si denatura ad alte temperature. In questo modo è possibile compiere più cicli di PCR.

Dopo aver letto l’articolo di Brock, il biochimico statunitense Kary Mullis pensò di usare la Taq polimerasi per la PCR; l’idea funzionò, tanto da fruttargli il premio Nobel nel 1983. Da allora, la PCR ha avuto grande importanza nella ricerca genetica e trova tuttora straordinarie applicazioni.

Tutte le cellule contengono enzimi chiamati DNA ligasi che durante il processo di duplicazione del DNA uniscono i frammenti di Okazaki (vedi ▶capitolo B2). Quando i biologi riuscirono a isolare tali enzimi, si resero conto che potevano essere utili per saldare insieme due sequenze qualsiasi di DNA. Nel 1973, Stanley Cohen e Herbert Boyer tagliarono con enzimi di restrizione e poi unirono con una DNA ligasi due plasmidi di E. coli, ciascuno contenente un gene per la resistenza agli antibiotici. Il plasmide risultante, una volta reinserito in cellule di E. coli, le rese resistenti a entrambi gli antibiotici (▶figura 5). Era appena iniziata l’era del DNA ricombinante.

Come si ottiene la ricombinazione? Sappiamo che molti enzimi di restrizione effettuano tagli sfalsati a livello di una sequenza di riconoscimento palindroma (▶figura 6). In questo caso, i frammenti di restrizione terminano con due estremità a filamento singolo. Tali estremità contengono una sequenza di basi capace di legarsi a un’altra per complementarietà, perciò sono definite estremità coesive.

Dal momento che contengono estremità coesive complementari, i frammenti di restrizione possono unirsi tra loro in seguito alla formazione di legami a idrogeno tra le basi, indipendentemente dalla loro origine: ciò avviene grazie alle DNA ligasi, che stabilizzano i legami tra frammenti adiacenti unendo l’estremità 5' di uno di essi con l’estremità 3' di quello vicino. Alcune DNA ligasi sono in grado di unire (con meccanismi un po’ diversi) anche frammenti di restrizione con estremità «piatte».

Le ligasi sono molto sensibili alla temperatura (che ha molta influenza sui legami a idrogeno) e richiedono ATP per funzionare. Utilizzando questi enzimi, i biologi molecolari riescono a produrre DNA ricombinante «tagliando e cucendo» molecole di DNA provenienti dalle fonti più diverse. Per poter unire molecole di provenienza diversa è però necessario che le estremità coesive dei due frammenti siano complementari; ciò è possibile solo se entrambi sono stati tagliati dal medesimo enzima di restrizione.