Consideriamo un individuo eterozigote per due geni (LlGg), nel quale gli alleli L e G provengano dalla madre mentre gli alleli l e g provengano dal padre. Quando questo organismo produce i gameti, gli alleli di origine materna (L e G) devono per forza finire insieme in uno stesso gamete e quelli di origine paterna (l e g) in un altro, oppure un gamete può ricevere un allele materno e uno paterno (L e g, come pure l e G)?

Per rispondere a questa domanda, Mendel progettò un’altra serie di esperimenti. Cominciò con dei ceppi di pisello che differivano per due caratteristiche del seme: la forma e il colore. Un ceppo parentale puro produceva soltanto semi lisci e gialli (LLGG), mentre l’altro produceva soltanto semi rugosi e verdi (llgg). Dall’incrocio fra questi due ceppi si otteneva una generazione F₁ nella quale le piante avevano tutte genotipo LlGg. Poiché gli alleli L e G sono dominanti, i semi erano tutti lisci e gialli.

Mendel continuò l’esperimento fino alla generazione F₂ compiendo un incrocio diibrido (ovvero un incrocio fra individui che sono tutti doppiamente eterozigoti) fra piante di F₁; in pratica, si limitò a lasciare che le piante di F₁ si autoimpollinassero. Secondo Mendel, (che, come dobbiamo ricordare, non aveva mai sentito parlare di cromosomi o di meiosi), esistevano due diversi modi in cui tali piante doppiamente eterozigoti potevano produrre gameti.

1. Gli alleli L e l potevano conservare la relazione che avevano nella generazione parentale (cioè essere associati). In questo caso le piante F₁ avrebbero prodotto due soli tipi di gameti (LG e lg) e la progenie di F₂ risultante dall’autoimpollinazione avrebbe dovuto essere composta da piante con semi lisci e gialli e da piante con semi rugosi e verdi, con un rapporto 3:1. Se questo fosse stato il risultato, non ci sarebbe stata ragione di pensare che la forma e il colore del seme fossero regolati da due geni diversi, dato che i semi lisci sarebbero stati sempre gialli e quelli rugosi sempre verdi.
2. Gli alleli L e l si potevano distribuire in modo indipendente da come si distribuivano G e g (cioè i due geni potevano essere indipendenti). In questo caso la F₁ avrebbe prodotto in ugual misura quattro tipi di gameti: LG, Lg, lG e lg. Dalla combinazione casuale di questi gameti si sarebbe generata una F₂ con nove genotipi differenti. La progenie di F₂ avrebbe uno fra tre genotipi possibili per la forma (LL, Ll e ll) e uno fra tre genotipi possibili per il colore (GG, Gg e gg) che, combinati fra loro, danno nove genotipi. I fenotipi corrispondenti sarebbero stati quattro: liscio giallo, liscio verde, rugoso giallo e rugoso verde. Se inserisci questi dati in un quadrato di Punnett, puoi prevedere che questi quattro fenotipi si sarebbero presentati nei rapporti numerici di 9:3:3:1 (▶figura 7).

Gli incroci diibridi di Mendel confermarono la seconda previsione: in F₂comparvero infatti quattro fenotipi differenti in un rapporto di 9:3:3:1. In una parte della progenie le caratteristiche parentali si presentarono in combinazioni inedite (liscio con verde e rugoso con giallo), che prendono il nome di fenotipi ricombinanti.

Questi risultati indussero Mendel alla formulazione di quella che è nota come terza legge di Mendel o legge dell’assortimento indipendente dei caratteri: durante la formazione dei gameti, geni diversi si distribuiscono l’uno indipendentemente dall’altro. In altre parole, considerando i due geni A e B, la separazione degli alleli del gene A è indipendente dalla separazione degli alleli del gene B.

Oggi sappiamo che questa legge non è universalmente valida come la legge della disgiunzione; essa infatti si applica ai geni posizionati su cromosomi distinti, ma non sempre a quelli collocati su uno stesso cromosoma, come vedremo nelle prossime pagine. A ogni buon conto, non si sbaglia dicendo che durante la formazione dei gameti i cromosomi si riassortiscono l’uno indipendentemente dall’altro, e che così fanno due geni qualsiasi situati su coppie di cromosomi omologhi distinti (▶figura 8).